Kromosoomianalüüsil kontrollitakse valgusmikroskoobis inimese kromosoomide arvu ja ehitust. Kromosoomid on valkudega kokku pakitud DNA-molekulid, mis ilmuvad nähtavale jagunevates rakkudes. Inimesel on igas rakus 46 kromosoomi: 1.-22. kromosoom (autosoomid) esinevad paarikaupa, lisaks moodustub kombinatsioon sugukromosoomidest X ja Y. Sugukromosoomidest sõltub inimese sugu, seda näitab kromosoomivalem ehk karüotüüp. Normaalne naise karüotüüp on 46,XX ja normaalne mehe karüotüüp on 46,XY. Inimese normaalseks arenguks on kõik 46 kromosoomi ilmtingimata vajalikud, muutused kromosoomide arvus ja ehituses põhjustavad kromosoomhaigusi.
Kromosoome saab uurida ainult paljunevates rakkudes, kus kromosoomid on kokku pakitud ja valgusmikroskoobis nähtavad. Seetõttu on uuringuks võetud proovimaterjali vaja laboris kasvatada. Alles siis kui rakukultuuris on tekkinud piisavalt palju jagunevaid rakke, saab teha kromosoomide uurimiseks mikroskoobipreparaadid.
Pilt 2: Kromosoomipreparaat. Rakutuumad ja kromosoomid 100x suurendusega.
Inimese ühe raku kromosoomid 1000x suurendusega. Foto: Kadi Jairus
Et kromosoomid oleksid valgusmikroskoobis nähtavad (suurendus 1000x), on neid vaja värvida. Värvimise tulemusena tekib kromosoomidele iseloomulik vöödistus. Levinuim vöödistuse meetod on G-vöödistus. Mida pikemad on kromosoomid, seda rohkem vööte nähtavale ilmub ja seda täpsem on analüüs. Rahvusvaheliselt aktsepteeritud tase on 400-550 vööti haploidse karüotüübi kohta. Enamus tööst toimub valgusmikroskoobis, kuid kromosoomianalüüsil on abiks ka spetsiaalne tarkvara, mida kasutatakse töö hõlbustamiseks ja dokumenteerimiseks. Analüüsi käigus loetakse üle vähemalt kaheteistkümne raku kromosoomide arv ja analüüsitakse iga kromosoomi mustrit vöötide kaupa. Hindamine toimub rahvusvahelise tsütogenenoomika nomenklatuuri (ISCN) järgi. Kromosoomianalüüsi tulemusena väljastatakse vastusena patsiendi kromosoomivalem ehk karüotüüp.
Pilt 3: Normaalse naise karüogramm. Vastav karüotüüp ehk kromosoomivalem on 46,XX.
Pilt 4: Normaalse mehe karüogramm. Vastav karüotüüp ehk kromosoomivalem on 46,XY.
Kromosoomianalüüsil on võimalik tuvastada ainult suuremaid kromosoomide ehituse muutusi, mis on vähemalt 5Mb (5 miljoni DNA aluspaari) suurused. Samuti pole G-vöödistusega võimalik identifitseerida väikeste lisakromosoomide päritolu ning muutusi selliste kromosoomiosade vahel, millel on sarnane vöödistuse muster. Vastavalt patsiendi näidustusele tehakse vajadusel täiendavad analüüsid: näiteks FISH-analüüs, submikroskoopiline kromosoomianalüüs või mõni molekulaardiagnostiline analüüs.
FISH ehk fluorestsents in situ hübridisatsioon on meetod, mis võimaldab tuvastada kindlate nukleiinhapete järjestuste esinemise (ja asukoha) kromosoomis või rakutuumas.
Pilt 1. Fotol on nähtav FISH analüüs 22. kromosoomi regioonis 22q11.21 deletsiooni välistamiseks. Punane signaal on seostunud 22q11.21 regiooniga, roheline signaal on nn kontrollproov 22. kromosoomi tuvastamiseks. Paremal on nähtavad signaalid kromosoomidel, vasakul rakutuumas. Tegemist on normaalse tulemusega, sest mõlemas rakus on olemas nii regiooniga seostunud kui ka kontrollproovi signaal
FISH analüüsi abil on võimalik nähtavaks teha palju väiksemaid muutuseid kui tavalisel kromosoomianalüüsil G-vöödistusega. Selleks kasutatakse fluorestseeruva märgisega seotud DNA molekule (enamasti pikkusega 100 – 600 kb e 100 000 – 600 000 aluspaari), mis kromosoomipreparaadi töötlemise käigus seostuvad ainult kindla kromosoomipiirkonnaga. Järgneval analüüsil fluorestsentsmikroskoobis tuvastatakse kromosoomil värviline signaal vaid juhul, kui see piirkond on kromosoomis olemas. FISH-meetodiga saab uuringut teha nii metafaasi kromosoomidel kui ka interfaasis olevate rakkude tuumadel, sest värvilise signaaliga molekulid seostuvad ka lahtipakitud DNA-le. Viimasel juhul ei ole näha, millises kromosoomis just uuritav piirkond paikneb, küll aga saab teada vastavate piirkondade olemasolu ja arvu rakus. Kui on tegemist uuritava piirkonna deletsiooniga, siis signaali ei ole. Tavaliselt kasutatakse ühes analüüsis mitut eri värvi märgisega seotud DNA molekuli.
FISH-analüüs leiab täiendava uuringuna kasutamist:
A - sünnieelses diagnostikas, kui on kahtlus sagedasemate arvuliste kromosoomihaiguste (13., 18., 21., X, Y) esinemise osas lootel ning infot on kiiresti vaja. Vastuse saab ligikaudu 48 tundi pärast sünnieelse protseduuri tegemist. Interfaasi FISH analüüs ei anna informatsiooni kogu karüotüübi kohta, vaid ainult nende piirkondade koopiaarvu kohta, mille DNA-proov kasutusel oli. Sünnieelses diagnostikas järgneb tavaliselt interfaasi FISH uuringule kogu karüotüübi analüüs kultiveeritud amnioni- või koorionirakkudest või ülegenoomne uuring võimalike patogeensete koopiaarvu muutuste tuvastamiseks
B – lisaanalüüsina kui tekib vajadus identifitseerida markerkromosoomi või täpsustada murrukohti kromosoomide translokatsiooni korral. Analüüsi saab teha kui on olemas vastavad märgistatud DNA-molekulid.
C - traditsioonilise G-vöödistuse kõrval kui patsiendi kliinilised tunnused viitavad kindla kromosoomipiirkonna defektile, kuid muutus on nii väike, et pole valgusmikroskoobis nähtav – nn. mikrodeletsiooni või mikroduplikatsiooni sündroomid. Praegusel hetkel on selliste muutuste tuvastamiseks kasutusel pigem ülegenoomne koopiaarvu määramise analüüs ehk submikroskoopiline kromosoomianalüüs.
Pilt 2. Fotol on nähtav FISH analüüs ägeda leukeemiaga patsiendi luuüdi rakutuumadel. Punane signaal näitab regiooni 12p13(ETV6) ja roheline signaal 21q22.1(RUNX1). Tegemist on 21q22.2(RUNX1) kordistumise ehk amplifikatsiooniga
D – hematoloogiliste kasvajate diagnostikas, kus analüüsitakse leukeemia- ja lümfoomispetsiifiliste muutuste esinemist, mis aitab raviarstil täpsustada kasvaja tüüpi, valida õiget ravitaktikat, hinnata ravi efektiivsust ning anda täpsemat prognoosi.
E - tahkete kasvajate diagnostikas kasutades koelõikude preparaate, külmutatud koest tehtud preparaate või värske koe puutepreparaate. Iga analüüsi jaoks on tarvis kindlat, otsitava muutuse põhist DNA proovi. Võimalik on määrata näiteks Her2 regiooni amplifikatsiooni, ALK geeni struktuurimuutust, erinevaid lümfoomidega seotud translokatsioone jne.
Vajadusel lisainfo FISH-analüüsi võimaluste kohta laboris: 7319496
Igasugune kromosoomide arvu, suuruse või struktuuri muutus toob kaasa muutusi geneetilise informatsiooni mahus ja/või asukohas. See omakorda võib põhjustada terviseprobleeme. Kromosoomide struktuurseid muutusi (k.a geneetilise materjali kadumine e. deletsioonid, lisandumine e. duplikatsioonid, ümber paigutamine e. translokatsioonid) seostatakse neuroloogiliste ja psühhiaatriliste haigustega, arengupeetusega ja kaasasündinud anomaaliatega.
Üheks meetodiks, mis võimaldab päriliku materjali hulga muutusi detekteerida, on submikroskoopiline kromosoomianalüüs. Üldiselt tuvastatakse antud meetodil kromosoomide muutusi u 17–20%-l arenguprobleemide ja/või intellektipuudega patsientidest. DNA koopiaarvu variatsioonide (CNV) uurimiseks kasutatakse geenikiipe. Meil kasutatava Human CytoSNP-12 kiibiga on võimalik analüüsida u 220 000 kindlaksmääratud üksiknukleotiidi muutust (SNP) ning markerit, mis katavad ligikaudu 250 tsütogeneetiliste uuringute käigus tavapäraselt analüüsitavat geneetilist regiooni (k.a subtelomeersed regioonid, peritsentromeersed regioonid, sugukromosoomid, lisaks proovid ~400-st geneetiliste haigustega seotud geenist). Saadud andmeid analüüsitakse erinevate tarkvaradega. Kasutatavad programmid arvestavad CNV-de leidmisel kahte parameetrit – fluorestsentsintensiivsuste suhet (logR ratio) ning alleelisagedust (allele frequency). Seetõttu võimaldab kasutatud metoodika lisaks CNV-de kindlaksmääramisele ja kaardistamisele saada informatsiooni ka aberratsiooni päritolu ning koopiaarvuneutraalsete ümberkorralduste (heterosügootsuse kadu, uniparentaalne disoomia) kohta. Kui tavalise perifeerse vere kromosoomianalüüsi lahutusvõime on ca 5-10Mb, siis submikroskoopilise kromosoomianalüüsi lahutusvõime on minimaalselt 50–100 kb.
Submikroskoopilist kromosoomianalüüsi kasutatakse järjest sagedamini ka sünnieelses diagnostikas ja samuti kasvajates tekkinud koopiaarvu muutuste tuvastamiseks.
Submikroskoopilisel kromosoomianalüüsil tuvastatud deletsioon 22. kromosoomis (DiGeorge sündroom)
Näidustused submikroskoopiliseks kromosoomianalüüsiks:
Postnataalne
• füüsilise ja/või vaimse arengu probleemidega patsiendid, kus tavakarüotüübil pole muutusi oodata (või pole muutusi leitud)
• autismispektriga haigused
• kaasasündinud arenguriketega ja düsmorfsed patsiendid, kus puudub viide kindlale sündroomile
• tsütogeneetilise leiu täpsustus
Prenataalne
• UH-leid
• koekultuur ei kasva (hukkunud looted)
• komplitseeritud anamnees
• tsütogeneetilise leiu täpsustus
Hematoloogiline
• tsütogeneetilise leiu täpsustus
• kahtlus selliste muutuste esinemisele, mida ei ole võimalik tavakarüotüpiseerimise ja FISH analüüsiga tuvastada
Tsütogeneetika labor
Geneetika labor Tallinnas
Geneetika ja personaalmeditsiini kliinik
L. Puusepa 2
telefon 731 9310